大豆在暗誘導下光週期及衰老相關基因的差異表達研究

　　《大豆在暗誘導下光週期及衰老相關基因的差異表達研究》講述了：黑龍江省是我國大豆主要生產基地，加入世貿組織後，大豆面臨嚴重的進口壓力。主要原因是我國大豆單產低，競爭力不強。大豆屬於短日照植物，其生長發育對光週期反應非常敏感，這一特性嚴重阻礙大豆品種的適應性，是制約大豆單產提高和穩產的關鍵因素。暗處理相當於短日照，可以縮短大豆的開花和成熟期，其表型之一是加速葉片的衰老。葉細胞的結構、代謝和基因表達都協調的發生變化，細胞器官的組分被依次有序的分解。代謝變化包括合成代謝活性的減弱，如光合作用和蛋白質的合成，以及分解代謝的加速，如核酸降解和蛋白水解。這些對維持植物生長和生殖是非常必要的，基因轉錄物丰度的巨大變化揭示了從有光合活性的葉片到作為流動營養物來源的衰老器官來維持發育的轉變情況。
　　為了打破大豆種植區域的侷限性，本研究在細胞分子水平上從基因差異表達的角度研究短日照光週期誘導開花和衰老過程中基因轉錄丰度的變化，克隆與大豆光週期反應及衰老有關的基因，從而探索大豆葉片感受日長變化誘導開花和衰老的複雜機制。雖然植物花器官的分化發生在頂端分生組織，在開花過程中的基因表達也必然在頂端分生組織中有所反映，然而植物感受光的器官是葉片，並利用長距離信號通過韌皮部傳導至頂端分生組織（SAM）影響生殖生長，在光週期控制開花過程中也必然牽涉葉片中很多基因的互作。由於黑暗的長度是開花時間的關鍵決定因素，在光週期控制開花過程中基因可能在夜間表達有差異，所以，以晝夜交替時的大豆的兩個樣本的葉片為研究目的對象，構建了差異表達的cDNA消減文庫，發現與暗誘導相關的差異表達基因，揭示了有關參與機體暗適應下蛋白質的上調表達的信息，為進一步分離暗處理產生差異表達基因奠定了基礎。
　　通過轉化短日照菸草，進行光週期反應基因的功能驗證，分析該類基因在光週期反應中的作用。同時，研究外源激素的施加對光週期途徑相關轉錄因子基因表達的影響；分析開花誘導中基因組織特性的表達情況。本研究的宗旨是通過基因的克隆和改造，試圖從根本上改變大豆對光的敏感性，為大豆高產穩產提高尋找新的突破口，從根本上扭轉我國大豆依賴於進口的被動局面。
　　主要結果如下。
　　1.本試驗首次應用抑制性消減雜交（SSH）技術以東農u3大豆的短日照（8h光/16h暗）和長日照（16h光/8h暗）兩個樣本為研究目的對象，構建了含有1738個克隆的差異表達的cI）NA消減文庫，對148個克隆進行測序，在此基礎上發現了76個與暗誘導相關的差異表達ESTs（上調至少3倍），根據Blastn和Blastx推測這些ESTs的功能包括參與轉錄、信號轉導和細胞凋亡的調節類蛋白；參與大分子降解的酶類如蛋白和核酸的降解、參與細胞壁修飾的合成代謝、初級代謝以及次級代謝的酶類和解毒與防衛的壓力反應的基因。揭示了有關參與機體暗適應下蛋白質的上調表達的信息，為進一步分離短日處理產生差異表達基因奠定了基礎。
　　2.為了研究GmRAV在大豆短日照信號轉導中的可能作用，我們利用cDNA末端快速擴增（RACE）技術從大豆中克隆了編碼GmRAv的cDNA序列。序列分析結果表明，GmRAV基因編碼351個氨基酸，含有AP2/ERF和B3結構域，GenBank登陸號為DQ147914，其DNA序列與辣椒、水稻和擬南芥RAV基因高度同源。
　　3.Real-time RT-PCR分析在短日照和長日照條件下大豆葉片中GmRAV基因mRNA轉錄物的丰度變化，表明該基因的丰度在短日照（SD）時都要顯著高於在長日照（LD）條件下的丰度。
　　4.分析GmRAV基因在不同組織中mRNA轉錄物的丰度變化表明，SD強烈誘導GmRAV基因在葉、根和莖中的表達。
　　5.構建了植物表達載體pBI121-GmRAV，用農桿菌介導法轉化菸草過量表達該基因，獲得卡那黴素抗性植株54株。PCR方法鑑定Tn轉基因株系，獲得18個轉基因的PCR陽性植株。通過Northern分析表明這4株轉基因菸草中的GmRAV基因都轉錄，表明它們都已成功轉入菸草中，並正常表達。
　　6.GmRAV過量表達的菸草植株與對照相比無論在長日照和短日照下植株都明顯矮小，節間距短，節數少，並且在土壤中生長時葉片更深綠，葉片小，GmRAV過量表達對莖和葉的發育以及植株的生長有推遲抑制作用。轉大豆GmRAV基因的菸草植株無論在長日照和短日照條件下均表現出開花延遲的特徵，並且光週期敏感性增強，非轉基因菸草在長日照比短日照條件下開花提前3天，而GmRAV過表達的菸草植株在長日照比短日照條件下開花卻提前13天。
　　7.GmRAV是BR信號轉導途徑的抑制因子，GmRAV基因通過抑制BR信號而抑制植物細胞伸長從而抑制生長，導致轉基因植株矮化。
　　8.GmRAV是GA生長信號轉導途徑中的促進因子，是ABA和黑暗促進衰老途徑中的促進因子。